成人耳念珠菌感染诊治防控专家共识
成人耳念珠菌感染诊治防控专家共识
引用：宁永忠.成人耳念珠菌感染诊治防控专家共识[J].临床检验杂志,2020,38(08):564-570.
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近年来，耳念珠菌(Candida auris)和耳念珠菌感染成为国内、国际(https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/)关注的热点。
该菌检测困难，容易漏检;大部分多重耐药，甚至泛耐药(pan-resistant)，治疗困难;其引起院内感染暴发的报道不断增加，亟需加强感染防控与监测。
中华医学会检验分会临床微生物学学组组织专家对该菌的病原学、流行病学、鉴定、抗真菌药物敏感性试验、同源性研究技术、诊断、处置、预防和控制等内容，进行阐述和推荐。
病原学
第一株耳念珠菌分离自外耳道感染。
auris，拉丁语含义为耳朵。
耳念珠菌属于棒孢酵母属的念珠菌分支(CTG clade)，该分支菌种的重要特点是开放阅读框中CTG三联体密码子通常编码丝氨酸，而不是传统的亮氨酸。
念珠菌分支的代表性临床致病菌种多达16余种，包括白念珠菌和热带念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、耳念珠菌等非白念珠菌物种。
耳念珠菌与希木龙念珠菌和葡萄牙念珠菌的进化关系比较密切，但与临床常见念珠菌如白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌相对较远。
该菌地理分布广泛，有千个以上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)差异，相应表型特征、毒力、耐药性等均不同。
基因组分析提示耳念珠菌存在5个不同的进化支:
南亚(印度/马来西亚/科威特/巴基斯坦)分支、
南非分支、
南美洲(委内瑞拉)分支、
东亚(日本/韩国)分支
和伊朗分支。
进化支间的变异和进化支内的同源性分析表明，相似度高的菌株可在多个地理区域独立出现。
该菌常呈多重耐药，一些菌株(型)对现有的3类抗真菌药均耐药。
该菌对氟康唑、两性霉素B或两者同时具有内源性或诱导型耐药。
美国2019年抗生素耐药威胁报告中将病原微生物威胁分为4个等级，即紧迫威胁(urgent threats)、严重威胁(serious threats)、需关注的威胁(concerning threats)和监视清单(watch list)，其中将耳念珠菌列为紧迫威胁。
一些常用的消毒剂不能杀灭该菌。
流行病学
日本于2009年最先报道耳念珠菌，患者是东京一名70岁女性。
国际抗真菌监测计划(SENTRY)中一组罕见念珠菌的调查显示，2009年之前耳念珠菌的分离极少，2004—2015年4大洲复核的15 271株分离株中，只有4株为耳念珠菌。
美国于2015年报道该菌，引起关注。
回顾性复核发现1996年韩国已分离出耳念珠菌临床菌株。
与2015—2017年平均值相比，美国2018年临床病例数共有323例，增长了318%。
中国内地最先由北京大学王辉教授团队于2018年报道该菌。
目前中国内地(大陆)、台湾和香港地区公开报道的耳念珠菌感染病例报道数量已达25例。
概括而言，该菌可引起重度感染，多重耐药时导致治疗困难，容易播散，可以引起暴发。
微生物学鉴定
3.1 疑似耳念珠菌的提示
遗传分析显示，该菌与葡萄牙念珠菌、希木龙念珠菌等关系较为密切。
推荐1:
以下情形须考虑耳念珠菌的可能性。
(1)念珠菌在25℃不形成假菌丝，42～45℃能够生长;
(2) Vitek YST:鉴定为希木龙念珠菌、葡萄牙念珠菌、C.duobuhaemulonii、无名念珠菌;
(3) API 20 CAUX:鉴定为胶红酵母(Rhodotorula glutinis)(但没有特征性红色素)、清酒念珠菌(C.sake)或鉴定结果不确定(unidentified);
(4) API Candida:鉴定为无名念珠菌;
(5) BD凤凰念珠菌鉴定卡:鉴定为希木龙念珠菌、链状念珠菌;
(6) Micro Scan:鉴定为白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、无名念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌;
(7) Rap ID Yeast Plus:鉴定为近平滑念珠菌;
(8)生物梅里埃质谱:鉴定为白念珠菌、希木龙念珠菌或鉴定结果不确定;
(9)念珠菌对唑类多重耐药或对两性霉素B耐药。文献报道，93%的耳念珠菌临床分离株对氟康唑耐药，33%对伏立康唑耐药，35%对两性霉素B耐药。
3.2 分离鉴定技术
该菌镜下形态学无特征性提示，需要菌落分纯后进行菌种鉴定。
正确鉴定要求人员意识到位、经验充足、质控在控，结果有可信性、重复性、可比性。
3.2.1 传统方法
推荐2:
Vitek 2 YST 8.01版本可以鉴定耳念珠菌;该版本鉴定的希木龙念珠菌、C.duobuhaemulonii，需要进一步判断是否耳念珠菌。
而BD凤凰念珠菌鉴定卡、Micro Scan、生物梅里埃API 20C、Rap ID Yeast Plus不能鉴定该菌。
推荐3:
显色培养基可做初步鉴定，但不能最终鉴定。
耳念珠菌在沙保弱琼脂培养基上菌落为白色或奶油色，在CHROMagar平板上为粉色或米黄色，培养第4天可变为淡粉红色或紫色。
念珠菌显色琼脂CHROMagar Candida或Chroma ID Candida可以初步区分希木龙念珠菌与耳念珠菌。
耳念珠菌在24 h内可长出更大的菌落，并且在24～48 h内菌落颜色从无色变为粉红色或米色。
该菌42℃生长良好(而希木龙念珠菌不能在42℃生长)，加0.01%放线菌酮不生长。因为颜色多样、无特征性，所以显色培养基无法做最终鉴定。
3.2.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assistedlaser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)
推荐4:
布鲁克质谱仪，MALDI Biotyper CA system(版本4)或Bruker RUO数据库(2014[5627]及以上版本数据库)可以鉴定该菌。
Bitoyper RUO数据库鉴定耳念珠菌准确率为75.4%～100%。
样本处理推荐乙醇/甲酸提取法。
推荐5:
生物梅里埃质谱仪，MS IVD 3.2版本(IVD)(该版本的数据库目前尚未获得美国食品药品监督管理局认可)或MS Saramis 4.14及以上版本(RUO)可以鉴定该菌。
生物梅里埃质谱仪Vitek MS的IVD 3.2版本鉴定耳念珠菌的准确率为96.7%,RUO数据库鉴定耳念珠菌的准确率为93.4%。
样本处理推荐直涂法。
3.2.3 分子生物学方法
推荐6:
用26S r DNA D1/D2区域或内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列作为菌种鉴定的目标，引物序列如下。
ITS上游引物:5'-GTCGTAACAAGGTTAA CCTGCGG-3'，下游引物:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3';26S r DNA D1/D2区上游引物:5'-GCATATCAATAAGCGGAG GAAAAG-3'，下游引物:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。
基于上述引物进行PCR扩增和测序，结果须可重复、可验证、可比较。
和Gen Bank数据库中耳念珠菌南亚、东亚、南非、南美或伊朗分支中任一分支的基因序列相比，序列比较一致性超过98%，认为是同一个菌种。
推荐7:
与耳念珠菌表型相近的希木龙念珠菌、葡萄牙念珠菌、Candida duobushaemulonii鉴别时，可考虑采用实时PCR(real-time PCR)方法。
耳念珠菌特异性引物:F:5'-C GCACATTGCGCCTTGGGGTA-3';R:5'-GTAGTCCTACCTGATT TGAGGCGAC-3'。
耳念珠菌及相关种属(耳念珠菌、希木龙念珠菌、葡萄牙念珠菌、Candida duobushaemulonii)特异性上游引物:5'-GCGATACGTAGTATGACTTGCAGACG-3';下游引物:5'-CAGCGGGTAGTCCTACCTGA-3'。
理由:
Kordalewska等用此体系对140株临床分离真菌菌株(含44株耳念珠菌、7株希木龙念珠菌、6株葡萄牙念珠菌、6株Candida duobushaemulonii、73株其他酵母样真菌和4株丝状真菌)进行鉴别，其结果与基于r DNA的测序结果100%一致。
3.3 原始标本的分子生物学检测
推荐8:
以耳念珠菌ITS2基因为靶标，用实时荧光PCR(Taq Man探针法)检测临床样本中的耳念珠菌，引物及探针序列如下。
ITS2基因特异性引物F:5'-CAGACGTGAAT CATCGAATCT-3',R:5'-TTTCGTGCAAGCTGTAATTT-3'，探针P:5'-FAM-AATCTTCGC-ZEN-GGTGGCGTTGCATTCA-IFQ-3'。
bicoid基因特异性引物F:5'-CAGCTTGCAGACTCTTAG-3',R:5'-GAATGACTCGCTGTAGTG-3'，探针P:5'-Quas570-AACGCT TTGACTCCGTCACCCA-IRQ-3'。
理由:
Leach等利用实时荧光PCR检测临床样本的敏感性介于89%～100%,Ahmad等进一步用247例确诊病人皮肤样本进行评价，证实该方法具有良好的诊断性能(敏感性93.6%，特异性97.2%)。
美国疾病控制与预防中心(https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/fact-sheets/factsheet-lab-staff.html)推荐该体系用于临床标本中耳念珠菌鉴定的PCR法。
抗真菌药物敏感性实验
在明确系耳念珠菌导致的感染时，药敏试验结果可指导临床治疗。
4.1 耳念珠菌药敏试验的适应证
推荐9:
对所有耳念珠菌分离株进行药敏试验。
非感染时，多重耐药耳念珠菌的分离有感控意义。
推荐10:
耳念珠菌导致侵袭性感染且之前抗真菌治疗效果不佳时，必须进行药敏试验。
推荐11:
耳念珠菌导致耳部感染，未进行抗真菌经验治疗、准备靶向治疗，或经验治疗效果不佳时，进行药敏试验。
4.2测试药物、方法和参数
常用的抗真菌药敏试验方法有微量肉汤稀释法(CLSI-BMD)、仪器法(Sensititre Yeast One、Vitek 2)和梯度稀释法(E-test)方法，这些方法检测耳念珠菌时最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)结果存在差异。
使用Vitek 2检测两性霉素B的MICs较高，而Sensititre Yeast One方法MIC值较低。
Sensititre Yeast One方法检测抗真菌药物敏感性的数据显示，氟康唑的MIC值很高，但其他唑类的MIC值非常低。
CLSI-BMD检测卡泊芬净的MIC可能会假性增高，一些研究还显示CLSI-BMD和EUCAST方法检测卡泊芬净敏感性存在实验室间差异。
一些学者推荐CLSI-BMD和E-test方法用于耳念珠菌的抗真菌药敏试验。
推荐12:
采用CLSI宏量肉汤稀释法为参考方法，测试5-氟胞嘧啶、唑类、棘白菌素类、两性霉素B的MIC。
操作和解释标准为CLSI M27 Ed4。
推荐13:
使用E-test法时，可以检测伏立康唑、卡泊芬净的MIC。
E-test法检测两性霉素B的MIC结果比参考方法低。
推荐14:
使用生物梅里埃Vitek AST YS07卡时，可以检测5-氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、卡泊芬净、米卡芬净的MIC。
其检测两性霉素B的MIC结果比参考方法高，结果不可信。
推荐15:
使用赛默飞Sensititre Yeast One®Y010时，可以检测5-氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净、两性霉素B的MIC。
推荐16:
目前没有使用ATB FUNGUS 3检测耳念珠菌耐药性的报道。
如果使用，需要进行验证和比对。
推荐17:
耳念珠菌试用性流行病学界值参照网站ht-tps://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-antifungal.html，见表1。
4.3 耐药机制检测
在氟康唑耐药的耳念珠菌菌株中，ERG11基因所编码的氨基酸置换F126L、Y132F和K143R的发生率远高于敏感株。
另外，由于ERG11编码的羊毛甾醇14α-去甲基化酶(ERG11p)是唑类药物作用的主要靶位，故ERG11的表达上调也可导致需更高浓度药物与ERG11结合从而引起耐药。
FKS1基因参与编码1,3-β-D-葡聚糖合成酶，这也是棘白菌素发挥作用的靶点。
FKS1的热点区编码S639F突变可能导致耳念珠菌对棘白菌素药物的亲和力降低从而引起耐药。
同源性技术研究
推荐18:
耳念珠菌聚集性或暴发性出现时，须进行同源性分析。
推荐19:
根据文献，推荐以下同源性分析技术。
(1)脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE):
韩国学者用PFGE技术对耳念珠菌进行同源性分析。
判断标准为:
菌株之间条带大小和数量一致，则认为是同一型别;
1～3条条带变化则认为是高度相近型别;
4条及以上条带变化则认为是不同型别。
(2)多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST):
通过PCR扩增4个管家基因内部片段(RPB1,RPB2,ITS和D1/D2)并测定其序列，分析菌株变异。
利用该方法，韩国学者确定了ST2型的流行株，印度学者成功区分来自印度、南非、巴西、日本和韩国的104株耳念珠菌并构建系统发育树。
(3) M13 DNA PCR:
Chowdhary等用M13 DNA PCR技术对12株耳念珠菌进行基因分型，结果成功区分10株来自印度和来自日本和韩国各1株的耳念珠菌的不同基因型。
(4)全基因组测序(whole genome sequencing,WGS):
在病原体溯源的所有分子分型技术中，WGS因分析范围广而具有最高的分辨力。SNP是基因组中最为广泛的变异，代表不同个体之间的遗传差异。
基于全基因组的SNP分析(whole genome SNP,wg SNP)提供了更多的SNP位点，通过比较SNP信息可以对菌型进行更细致的划分。
临床诊断
临床处置
预防和控制
参考网站(https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/cauris-infection-control.html)信息，作如下推荐。
8.1 预防用药
推荐35:
耳念珠菌病发病率低，不建议预防用药。
特殊情况确需预防用药，用药建议如上述治疗建议。
8.2 监测
8.3 感染控制
推荐41:
明确耳念珠菌定植或感染时，应对患者进行标准接触隔离措施。
条件具备则单间隔离，或与其他耳念珠菌患者同一房间。
可以将相同多重耐药定植菌患者置于同一房间。
医护人员及探视者需在标准预防的基础上进行接触隔离。
患者用具尽可能选择一次性用品。
推荐42:
严格遵循手卫生规范。
对有耳念珠菌分离的病区，出入的医护人员、探视人员应严格遵守手部卫生规范，用流动水和皂液洗手，再用酒精擦拭。
戴上手套前和移除手套后需进行手部卫生，注意戴手套不能代替手部卫生。
推荐43:
减少设备共用，做好个人防护。
尽量使用一次性医疗设备，或在相同病例之间共用设备，或将感染患者安排在当天最后进行操作，结束时彻底消毒。
个人防护用品应在洗手后、进入房间或患者区域前穿戴好，离开前将个人防护用品在患者房间内脱下并丢弃，之后进行标准的手部卫生。
如果存在患者血液、体液、皮肤等接触风险时，应穿隔离衣;存在溢出或泼溅风险时需佩戴护目镜和面罩。
推荐44:
加强环境清洁消毒。
推荐参照网站(https://www.cdc.gov/fungal/diseases/candidiasis/recommendations.ht-ml)信息。
推荐使用含氯消毒剂1 000 mg/L、每日3次常规环境消毒或10 000 mg/L终末消毒，或氯己定葡萄糖酸盐消毒。
患者离开，应进行终末消毒。
使用非接触式消毒(如紫外线)前，推荐对患者环境中的所有物品进行清洁。
皮肤去定植，推荐2%氯己定;耳念珠菌感染患者接受心胸手术前的皮肤准备，推荐10%聚维酮碘。
新型消毒剂SCY-078可以抑制生物膜形成。耳念珠菌可存在于患者的床、手机、摇床控制器、地板，医务人员工作区域的椅子、床单、医疗仪器，门把手、壁橱、洗手池、便盆和墩布池;医院感染暴发时还见于公用的腋温计、公用的血压袖带。
耳念珠菌在潮湿和干燥的表面存活至少14 d，在金属和床单位等能够存在7 d，在污染的被褥中存活7 d，甚至可以存在数月。
推荐45:
对有定植或感染的患者，进行标签提示，转运时要有信息传递。
患者病房门口悬挂隔离标识。
对有耳念珠菌分离的患者，单间隔离的同时，尽量减少接触人员的数量。
尽量减少患者转运，如须转运应将其耳念珠菌携带或感染状态信息传递给相关人员，做好标准隔离措施。
推荐46:
正确处理与患者相关的医疗垃圾及生活废物。
垃圾集中处理，避免废物污染环境。
洗手池与清洗池分开。
任何时候不应在洗手池中丢弃或清洗污染的物品。
小结
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